Rekayasa Bakteri untuk Ternak dan Manusia: Pembuatan Mutan Escherichia coli Penghasil Protein Rekombinan
Authors
-
Muhamad Ali
Laboratory of Microbiology and Biotechnology, Faculty of Animal Sciences, University of Mataram, Lombok 83125 Indonesia
-
Takako FUKUBA
Laboratory of Molecular Biotechnology, Faculty of Bioagricultural Sciences Nagoya University, Furocho,Chikusa-ku,Nagoya 464-01, Japan
-
Hideo NAKANO
Laboratory of Molecular Biotechnology, Faculty of Bioagricultural Sciences Nagoya University, Furocho,Chikusa-ku,Nagoya 464-01, Japan
Keywords:
mutan defisiensi-protease, transduksi phage P1, disrupsi kromosomAbstract
Protein rekombinan seperti vaksin, antibodi, hormon, dan obat-obatan, semakin dibutuhkan oleh ternak dan manusia. Hambatan utama untuk menghasilkan protein rekombinan pada Escherichia coli sebagai inang yang digunakan paling luas adalah degradasi oleh enzim proteolitik. Hal ini disebabkan karena E. coli memiliki sejumlah enzim proteolitik yang tersebar di dalam sitoplasmanya. Untuk itu, lebih dari 90% degradasi protein terjadi di dalam sitoplasmanya. Pada penelitian ini, peneliti telah menghasilkan mutant E. coli BW25113 yang tidak memiliki gen penyandi enzim protease dengan menggunakan kombinasi metode pengerusakan kromosom dan metode transduksi phage P1. Pembuatan mutan tersebut dimulai dengan pengerusakan gen penyandi enzim protease pada kromosom bakteri dengan produk PCR yang memiliki bagian yang homolog dengan gen target. Mutan-mutan yang dihasilkan kemudian digunakan untuk menghasilkan mutan ganda dengan metode Transduksi phage P1. Analisis fenotif dan genotif menunjukkan bahwa kombinasi kedua metode tersebut sangat efektif untuk membuat lebih dari satu mutasi pada E. coli. Untuk itu, mutan E. coli yang telah diperoleh akan sangat bermanfaat untuk menghasilkan aneka protein rekombinan untuk ternak dan manusia.References
Cherepanov PP and Wackernagel W 1995. Gene disruption in Escherichia coli: TCR and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene, 158, 9-14.
Datsenko KA and Wanner BL 2000. One-step inactivation of chomosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 97, 6640-6645.
Fujii R, Kitaoka M, and Hayash K 2004. One-step random mutagenesis by error-prone rolling circle amplification. Nucleic Acids Research, 32: e145.
Goff SA and Goldberg AL 1987. An increased content of Protease La, the lon gene product, increases protein degradation and blocks growth in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 262, 4508-4515.
Gotesman S 1996. Proteases and their targets in E. coli. Annu. Rev. Genet. 30, 465-506.
Hengge R and Bukau B 2003. Proteolysis in prokaryotes; protein quality control and regulatory principles. Mol. Microbiol., 49; 1451-1462.
Ignatova Z, Mahsunah A, Giorgieva M, and Kasche V 2003. Improvement of postranslational bottlenecks in the production of penicilin amidase in recombinant Escherichia coli strains. Appl. Environ. Microbiol., 69, 1237-1245.
Jiang XP, Oohira K, Iwasaki Y, Nakano H, Ichihara S, and Yamane T 2001. Reduction of protein degradation by use of protease-deficient mutants in cell-free protein synthesis system of Escherichia coli. J.
Biosci. Bioeng., 93, 151-156.
Jones CH, Dexter P, Evans AK, Liu C, Hultgren SC, and Hruby DE 2002. Escherichia coli DegP protease cleaves between paired hydrophobic residues in a natural substrate: the PapA pilin. J. Bacteriol., 184, 5762-5771.
Kersten B, Feilner T, Kramer A, Wehrmeyer S, Possling A, Witt I, Zanor MI, Stracke R, Lueking A, Kreutzberger J 2003. Generation of Arabidiopsis protein chips for antibody and serum screening. Plant Mol. Bio., 52, 999-1010.
Kristensen J, Petersen HUS, Mortensen KK, Sorensen HP 2005. Generation of monoclonal antibodies for the assessment of protein purification by recombinant ribosomal coupling. Int. J. Biol. Macromolecules, 37, 212-217.
Li S and Wilkinson MF 1998. Nonsense surveillance in lymphocytes. Immunity, 8, 135-141.
Lombardi A, Sperandei M, Cantale C, Giacomini P, Galeffi P 2005. Functional expression of a singlechain antibody specific for the HER2 human oncogene in a bacterial reducing environment. Protein Expr. Purif., 44., 10-15.
Miller JH 1972. Experiments in molecular genetics, p. 201-205. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
Okuno K, Yabuta M, Ohusye K, Ooi T, and Kinoshita S 2002. An analysis of target preferences of Escherichia coli outer-membrane endoproteases OmpT for use in theraupetic peptide production: efficient cleavage of substrates with basic amino acids at the P4 and P6 positions. Biotechnol. Appl. Biochem., 36, 77-84.
Surpuran CT, Scozzafa A, and Clare BW 2002. Bacterial protease inhibitors. Med. Res. Rev. 22, 329-372.
Weichart D, Querfurth N, Dreger M, and Aronis RH 2002. Global role for clpP-containing proteases in stationary-phase adaptation of E. coli. J. Bacteriol., 185, 115-125.
Valdes R, Reyes B, Alvarez T, Garcia J, Montero JA, Figuroa A, Gomez L, Padilla S, Geada D, Abrahantes MC, Dorta L, Fernandez D, MendozaO, Ramirez N, Rodriguez M, Pujol M, Borroto C, Brito J 2003. Hepatitis B surface antigen immunopurification using a plant-derived specific antibody produced in large scale. Biochem. Biophys. Res. Commun., 310, 742-747.
Vasilyeva OV, Potapenko NA, and Ovchinnikova TV 2000. Limited proteolysis of Escherichia coli ATPdependent protease Lon. Suplement, 41, 124-126.
